开菲尔的生物学特性与活性功能研究进展
开菲尔（Kefir）作为一种传统的发酵乳饮料，在国内外有悠久的饮用历史，它具有特殊的营养价值与保健功效，深受人们的喜爱。国内外的学者、专家对其组成、活性功能及作用进行过许多研究，发现作为酿制开菲尔的发酵剂开菲尔粒（Kefir Grains，KG），能使开菲尔酸奶比普通酸奶营养更丰富、更易于消化，它的构成菌所分泌的许多发酵产物有生理保健功能，具有调节循环和呼吸系统功能、改善消化机能、提高钙的吸收利用等作用，尤其是开菲尔具有的抗氧化、降血压、降胆固醇、抗肿瘤等生理保健功能，已使其成为近年开发研究的热点。同时也发现，开菲尔能分泌细菌素、抗菌肽、溶菌酶等天然抗菌物质，在食品工业、医药行业都非常值得开发利用。
1 开菲尔的起源及营养功效
开菲尔是一种传统酒精发酵乳饮料，是以牛乳或山羊乳为原料，加入含有乳酸菌和酵母菌的开菲尔粒发酵剂，经发酵酿制而成[1]。它与传统的酸乳或用其他纯种乳酸菌发酵剂所制成的产品相比较，最显著的特征是除乳酸发酵外，还伴有轻微的由酵母菌引起的酒精发酵，是一种集酸味、醇味于一体的发酵乳制品。开菲尔起源于俄罗斯北高加索地区，在古时当地的山岳牧民将牛乳或山羊乳注入羊皮口袋经自然发酵生产酸乳酒，其残留物再补加牛乳或山羊乳继续发酵，经长期发酵后在皮口袋中形成不规则颗粒状物体，即为开菲尔粒。此后人们便直接将开菲尔粒添加到牛乳中，使之发酵而生成具有爽快酸味和起泡性的酒精性保健饮料。根据相关的研究报道，开菲尔发酵及成熟过程中，有益菌群会将牛乳中的乳糖大部分水解为对人体有益的L（+）乳酸，所以开菲尔含有容易被消化吸收的乳蛋白质和乳脂肪，对人体具有较高的营养价值[2]。开菲尔等发酵奶中非蛋白质氮以及游离氨基酸的含量比普通牛奶多，游离氨基酸有脯氨酸、亮氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、组氨酸等；碳水化合物丰富，主要有乳糖、半乳糖、葡萄糖以及微生物发酵产生的多糖；维生素主要有B族维生素，如B1、B2、B6、B12以及叶酸等，并有多种人体必需的矿物元素，如钙、镁、钾、磷、铁等，营养丰富，长期饮用后保健功效明显[3]。由于开菲尔有着特殊的营养和保健功能，对胃肠道疾病、便秘、代谢异常疾病、高血压、贫血、心脏病、肥胖症均有一定疗效，早在前苏联、西亚、南亚、东欧、北欧等地流行，最近在美国、加拿大以及日本等国也有越来越多的人饮用开菲尔，我国的东北、内蒙古、新疆和西藏地区人民，都有饮用开菲尔的历史，并把它称为牛奶酒、酸牛奶酒、奶酒、马奶子饮料、西藏灵菇等[4]。开菲尔是以牛奶为原料的发酵食品，它不但具有牛奶所含有的全部营养素，而且由于多种益生菌的相互作用使其营养比原乳有了更大的提高，是营养丰富、易于消化的保健食品。
2 开菲尔粒概述
开菲尔粒，是由多种乳酸菌、酵母菌等微生物经强烈的相互作用而形成的特殊粒状结构，其外形不规则，多数呈花椰菜状，也有少量的薄片状和旋涡状或纸卷样等结构，表面卷曲，不平整或高度扭曲[5]，直径大多在1～15 mm不等，最高可达20 mm以上，多为白色或淡黄色且富有弹性，主要成分是水、黏性多糖、少量蛋白质、脂质[6]，其比例约为890～900 g/kg水、2 g/kg脂类、30 g/kg蛋白质、60 g/kg糖类和7 g/kg矿物质[7]。开菲尔粒不溶于水，具有胶黏性，在乳中呈胶胨状的膨胀体。具有活性的开菲尔粒可浮在乳的表面生长、分裂并将其特性传给下一代以产生新粒，当其生长扩大时，数量的增加是依赖于原粒的分裂，粒由小变大，进而形成菌块[8]。菌块中约有50%的成分是由乳酸菌自身代谢向胞外分泌并蓄积的黏性多糖构成，它可作为微生物固定化的支撑体或栖息的多糖基质。前苏联、日本、德国的科学工作者，从20世纪初就开始研究开菲尔粒，但至今也没有仿制成功，虽然许多国家也有工业化生产的开菲尔问世，其口感和作用也与传统开菲尔基本相似，但仍不能形成开菲尔粒。根据现有技术条件，在没有原粒的条件下人们还无法合成新的开菲尔粒[9]。开菲尔粒是一个微生物的共生体系，不同来源的开菲尔粒是有差别的，但在微生物的组成种类上，主要含有乳球菌、乳杆菌、链球菌、明串珠菌[10-11]、酵母菌和醋酸菌等[12]。细菌中最多的是开菲尔乳杆菌（Lactobacillus kefir）、植物乳杆菌（L.plantarum）、醋化醋杆菌（Acetobacter aceti）[13]；酵母主要有乳酒假丝酵母（Candida kefir）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiace）[14]。周剑忠等对开菲尔粒和西藏灵菇中细菌和酵母的群落结构进行了比较分析[15]，认为西藏灵菇和开菲尔粒形态相似，都是乳白色、胶质状的块状物，上面都栖息着多种微生物，序列比对显示，开菲尔粒和西藏灵菇中细菌的16S rDNA的V3区序列，与乳酸菌16S rDNA 序列十分接近，其中最亮条带的序列与乳酸乳球菌的相似性为100%，其他共性条带所对应的为开菲尔囊乳杆菌、肠膜明串珠菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌。酵母的26S rDNA 的D1区序列分析表明，开菲尔粒和西藏灵菇中存在单孢酵母和假丝酵母。由此认为，开菲尔粒和西藏灵菇同属一个品系。
已有的研究表明，开菲尔粒是一个复杂的微生物体系，栖息着大量的益生菌，不同来源的开菲尔粒，由于其微生物的菌相和含量的差异，作为发酵剂制成的开菲尔，有着各自的风味特点和保健功能。因此，对开菲尔粒的活性功能进行更深层次的研究，将其抗菌物质在食品添加剂[16]、保健食品[17]等领域加以利用，其市场前景广阔。
3 开菲尔粒的特殊构成及功能的多样性
开菲尔粒是以数种细菌与真菌共生为基础，并由各自分泌的产物混合交织在一起而形成的菌块，其特殊构成形成了功能的多样性。目前虽然已经了解到构成菌的主要类型，但哪几种菌是开菲尔粒在构成上不可缺少的，或不影响作为开菲尔发酵剂功能的菌种还未明确。如开菲尔粒中有大量产生多糖的菌相存在，使得制品中一些葡萄糖、半乳糖等单糖参与多糖合成；开菲尔中的蛋白降解，在发酵的初期，微生物会大量利用游离氨基酸，脯氨酸、亮氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、组氨酸显著增加，但不清楚是何种菌或哪几种菌共同作用的结果。此外，在开菲尔粒的菌块中还会含有很多分类学尚难以确定的菌种，因此，开菲尔粒在构成上具有复杂性，在功能上具有多样性。
3.1 细菌的功能作用
已知的构成菌中，各种细菌发挥着不同的功能作用[2，18]。乳球菌属（Lactococcus）是开菲尔粒中含量最多、最具活力的一部分，最适生长温度在30～35 ℃，在发酵初期的数小时内能使乳糖按非氧化途径生产乳酸，迅速提高乳制品的酸度，当酸度达到115T时被抑制。乳杆菌属（Lactobacillus），在开菲尔粒中以短杆菌为主，最适生长温度为37～42 ℃，产酸能力较强，分解蛋白质生成氨基酸，使牛乳变黏稠。明串珠菌属（Leuconostoc），最适生长温度为20～30 ℃，能利用蔗糖合成大量荚膜葡聚糖，产生多量的B族维生素。醋酸菌类，在代谢时可合成维生素B2与B5，有维持开菲尔粒的菌相平衡和共生作用，同时还有提高开菲尔黏度的作用。
3.2 酵母菌的功能作用
在开菲尔粒中分布着包括乳糖发酵型和乳糖非发酵型的酵母菌，它在发酵中合成维生素B1、B2和B12，给开菲尔乳带来醇味、酯香和二氧化碳，使开菲尔具有碳酸饮料般的爽口感，但酵母菌不能过量，否则会产生大量的二氧化碳、乙醇和酵母臭而影响产品的风味[19]。若利用酵母菌和乳酸菌混合发酵，能有效提高牛奶中脂肪的降解率，但若比例不合适，也会抑制发酵乳中芳香物质的产生[20]。
3.3 菌体自身代谢产物的抗菌活性功能
在开菲尔粒的微生物类群中，已知有些细菌在生长代谢过程中，能分泌抗菌物质到胞外，如乳酸菌分泌的抗菌物质对肠道病原菌有抑制作用。Ryan等从开菲尔粒中分离出的乳酸菌株（Lactococcus lactis DPC3147），能产生一种具有广谱抗菌特性的细菌素，这种细菌素即使在加热条件下也具有良好的抗菌活性，热稳定性强[21]。王颖等从开菲尔粒中分离获得一株卵球状球菌，该菌株产生细菌素，它不仅可以抑制革兰氏阳性菌，对一些革兰氏阴性菌如大肠杆菌、志贺（氏）痢疾杆菌、铜绿假单胞菌以及恶臭假单胞菌均有较强的抑制作用[22]。
3.4 微生物类群的共生与相互作用
开菲尔粒的独特微生物组成，赋予了其许多独特的活性功能，它们相互之间存在的共生关系，使得其在分解蛋白胨生成维生素时，乳酸菌被酵母菌和醋酸菌激活，而只有在乳酸菌存在时，乳糖非发酵型酵母和醋酸菌才能生长。乳酸菌通过作用于乳糖产生乳酸，为酵母菌和醋酸菌生长提供了良好的生长环境。由乳酸杆菌占压倒优势的菌相所形成的开菲尔粒，发酵后的酸乳因产酸弱而不能作为发酵剂使用；相反，由乳酸链球菌占优势的菌相所形成的开菲尔粒，发酵后的酸乳可以作为发酵剂使用，制造开菲尔。
可见，开菲尔的营养品质、口感风味、保健功效，取决于开菲尔粒的功能，而构成开菲尔粒的微生物类型，其生物活性又决定着开菲尔粒的发酵功能。
4 开菲尔中的抗菌活性物质
开菲尔有如此多的功能作用，这与开菲尔粒发酵剂的特殊构成密不可分，开菲尔在发酵成熟过程中，数种细菌与真菌共同作用，尤其是乳酸菌、酵母菌，它们在生长代谢的过程中，各自将代谢产物分泌到开菲尔中，使得发酵乳集聚了许多目前还不清楚的抗菌素、抗菌肽类物质，从而形成了对某些疾病有疗效的功能物质，如已知的乳酸菌所生成的Nisin等抗菌物质，既有保鲜又有抗菌活性功效。同时，乳中的益生菌，当它定居于人体肠道内，成为肠道优势菌，又能起到抑制病原菌及肠道寄生菌的侵入增殖，所以，开菲尔除了具有一般酸奶的营养价值外，它还具有明显的保健作用。
4.1 从开菲尔粒中分离出产抗菌肽类物质的菌株
开菲尔中的抗菌物质，来自其构成菌的分泌产物。Ryan等从开菲尔粒中分离出的乳酸菌Lactococcus lactis DPC3147就是一种能产具有广谱抗菌性的细菌素[21]。王志博等从来自开菲尔颗粒的250株乳酸菌中，经分离筛选出一株具有较好抑菌活性的、命名为L11的乳酸乳球菌菌株，该菌株发酵上清液对金黄色葡萄球菌等有抑菌活性，属于类细菌素[23]。许女等从西藏开菲尔粒中分离出一株植物乳杆菌MA2，该菌株在pH 2.0、胆盐浓度为0.3%的环境中具有较好的耐受能力，经动物试验证明，植物乳杆菌MA2有调节大鼠肠道菌群的作用，显著促进了双歧杆菌和乳酸菌的生长，调节了肠道菌群的平衡，是一株潜在的、具有实际应用价值的益生菌[24]。
根据目前的研究报道，不少乳酸类细菌可以产生很多种抑菌活性物质，如羊毛硫抗生素、大分子热不稳定蛋白、小分子稳定的多肽类物质等[25]。有报道称，开菲尔中荚膜多糖有抑制肿瘤的活性[26]。
4.2 从开菲尔上清液中分离出抗菌活性物质
开菲尔中具有的抗菌活性物质，目前虽有研究报道，但还不太清楚具体属于哪种物质。黄曼曼等用水提法提取西藏开菲尔中的抑菌活性成分，研究结果表明，开菲尔中的提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌、黄曲霉及啤酒酵母均有明显的抑制效果，与尼生素相比，抑菌效果相当，抑菌谱更广；提取物在酸性和中性条件下抑菌活性稳定，而在碱性条件下抑菌活性减弱，且具有较好的热稳定性和光稳定性[27]。该抗菌物质后经郭浩贤用茚三酮显色法、基质辅助激光解吸飞行时间质谱、核磁共振波谱仪以及X射线衍射仪等方法进行结构鉴定，确定为蛋白类物质[28]；F3的分子量为452，是一个小分子的多肽，推断其由1个酪氨酸、1个异亮氨酸和2个磷酸根基团组成。Simova等通过分离、纯化的技术方法从开菲尔中得到有高效抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌等微生物的小分子多肽[29]。
4.3 开菲尔中抗菌物质的活性功能
关于开菲尔中抗菌物质的活性功能，Liu等以小鼠为动物模型，让接种肉瘤180肿瘤细胞的小鼠口服开菲尔，分析开菲尔对小鼠体内肿瘤生长情况的影响，结果表明，开菲尔对肿瘤的生长抑制率达648%，小鼠体内apoptotic肿瘤细胞发生裂解[30]。李永奇的研究认为，西藏灵菇奶（西藏称开菲尔为藏灵菇奶）对治疗慢性肠道疾病有一定的调节作用[31]。陶应龙等的试验表明，服用藏灵菇培养液对高脂血症患者血脂中的胆固醇有一定的降低作用[32]。Sarkar等报道，开菲尔提取物对伤口愈合的作用大于新霉素[33]。Diniz等的研究表明，开菲尔发酵乳具有抑制炎症发生的作用[34]。在消化保健方面，薄芯等的研究发现，西藏开菲尔发酵奶可提高小鼠肠道消化系统功能，增强体质[35]。在降低胆固醇方面，冉冉等以高脂大鼠为模型，研究藏灵菇源酸奶复合菌发酵剂发酵乳的降胆固醇功能，结果表明，藏灵菇源脱脂酸奶复合菌发酵剂有明显降低试验大鼠胆固醇的作用，藏灵菇源高产胆盐水解酶的乳酸菌作为一种预防和治疗动脉粥样硬化的功能性菌株，在开发降血清胆固醇功能性发酵乳制品方面具有利用价值[36]。
开菲尔中的乳酸菌含量多，根据徐致远的研究，乳酸菌具有调整并平衡胃肠道的微生态环境的作用[37]：首先，乳酸菌可以产生抑菌物质，如细菌素、类细菌素、过氧化氢、乳酸、乙酸等，能抑制肠道内有害菌的繁殖、代谢，进而起到调节肠道菌群的作用；其次是有黏附功能，乳酸菌表面有能与肠黏膜细胞牢固结合的特异性物质，如磷脂壁酸、肽聚糖或细胞表层蛋白等，这些物质使乳酸菌黏附在肠道上皮上，构成了肠道定殖抗力，从而可以起到阻止病原菌的定殖和入侵的作用；另外，具有营养物质竞争的机制，在营养物质有限的情况下，乳酸菌可以通过其优势生长，竞争性消耗潜在致病菌的营养素，改善并决定肠道菌群的分布。王春敏等的研究报道，藏灵菇酸奶有调整人体面部皮肤的微生态循环系统作用，对寻常性痤疮也有一定的治疗功效[38]。Shigeru 等研究表明，开菲尔中含有1，2甘油二酯，它能去除压力激素对免疫应答系统的抑制作用，同时它含有的脂质能消除皮质醇对人体的不良影响[39]，从开菲尔粒中分离得到的L.kaf iranofasiensGKL[40]分泌的荚膜多糖也能降低人体皮质醇和去甲肾上腺素的分泌量。
5 结语
开菲尔粒是由一个复杂的微生物体系所构成，栖息着多种类的细菌和真菌，用它发酵酿制出的开菲尔，营养丰富，含有大量的益生菌、抗菌素、抗菌肽类物质，有特殊的风味特点和保健功能。目前对开菲尔的研究多集中在生产工艺的条件研究以及开菲尔的菌相构成上，对它的保健功能的机理研究较少，开菲尔中的抗菌活性物质源自何种菌类，尚不明确，合成或分泌的机制也不清楚。为此，深入研究、挖掘开菲尔中的各种抗菌活性物质，查明其活性功能是非常必要且有重大利用价值的研究课题。
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